Tıbbın Geleceği: CRISPR/Cas9 Teknolojisi

Sevgili okur! Çayını, kahveni alıp en iyi rahat ettiğin pozisyona geçmeni tavsiye ederim. Şimdi daha önce hiç duymadıysan ufkunu açacak, duyduysan ufkunu genişletecek bir konu hakkındaki bu yazı seni bekliyor. Lütfen arada sıkılıp yarım bırakma. Sonuna kadar sabret zira pişman olmayacaksın.

CRISPR- Cas       Sistemi, CRISPRs ve Cas9 genlerinden oluşan ve prokaryotik türlerde yabancı DNA moleküllerini yok etmek suretiyle istilacı türlere karşı immün yanıt oluşturan bir sistemdir (1). Bu sistemde birtakım değişiklikler yapılarak insan hücrelerinde DNA yapısının değiştirilebileceğinin ve böylelikle genetik hastalıkların tedavi edilebileceğinin anlaşılması üzerine 21. yüzyılın en heyecan verici bilimsel gelişmesi olan CRISPR/Cas9 teknolojisi ortaya çıkmıştır. Bu teknoloji sayesinde CRISPR/Cas sisteminin bileşenleri çeşitli gen bölgelerine yönlendirilerek bozuk genler kesilebilir, DNA’ya yeni genler eklenebilir, mutasyonlu alleller normal alleller haline dönüştürülebilir ya da istenilen genlerin ekspresyonu artırılıp-azaltılabilir (2,3). Ayrıca son yayınlar bu teknoloji sayesinde çift zincir kırığı yapmadan tek bir nükleotitte de değişiklik yapılabileceğini (4), (Lütfen bu cümlenin ağırlığının farkına var. Genetik hastalıkların yaklaşık yarısı tek nükleotit hatalarından kaynaklanmaktadır.) DNA’yı kesmeden istenilen genlerin susturulabileceğini (5) ve sadece DNA’nın değil RNA’nın da düzenlenebileceğini (6) (Son 2 ifade ile şunu anlatmak istiyorum: Sadece genomda değil epigenomda da değişiklik yapabiliriz.) bildirmektedir.

CRISPR/Cas9 teknolojisi Stanford Üniversitesi’nden Jennifer Doudna ve arkadaşları tarafından 2013 yılında keşfedilmiştir. Ardından Doudna, patentini aldı. Ama Harvard Üniversitesi’nden Feng Zang de bu teknolojinin uygulanması ile ilgili önemli çalışmalara imza attı ve o da çalışmaları ile ilgili patent aldı. İkisi de milyar dolarlık değeri olan şirketler kurdular ve aynı zamanda Emmanuelle Charpentier ile birlikte Nobel Ödülünün de en büyük adayları arasındalar. Tabi çalışmalar sadece ABD’de yapılmıyor. Çin de bu teknolojinin kullanımı konusunda iddialı. (Haberlerde okumuşsunuzdur. Çinli bir bilim insanı(!) HIV’e karşı direnç kazandırttığı iki bebeğin Dünya’ya geldiğini iddia etti. Nasıl olabilir bu? Elbette ki CRISPR/Cas9 ile.) 2. Dünya Savaşı sonrası ABD ile Sovyetler uzaya çıkma yarışında idi. Şimdi de ABD ile Çin arasında hastalıkları tedavi etmek için benzer bir yarışın olduğunu söyleyebilirim. Dolayısıyla bizler de bu yarışa dahil olmalıyız. Bir yerden başlamak gerekiyorsa o da hiç kuşkusuz okumaktır. Önce okuyalım, düşünelim. Ardından fikirler ortaya çıkacaktır. Haydi okumaya devam J

Bu teknolojiye neden milyar dolarlık yatırımlar yapılıyor? Neden ülkeler adeta birbirleri ile yarışıyor? Çünkü 21. Yüzyılın en heyecan verici bilimsel gelişmelerinden biri olan CRISPR/Cas9 teknolojisi gelecek için çok büyük umutlar vaat etmektedir. Sadece genetik hastalıklar olarak düşünmeyin. Kanser, kalp damar hastalıkları, nörodejeneratif hastalıklar vb. hastalıklarda da kısaca tüm tıpta kullanım potansiyeli barındırmaktadır. Bu potansiyelleri keşfedecek bilim insanları arasında neden bizler de yer almayalım?

Şimdi sizlere bu teknolojinin kullanıldığı bazı bilimsel çalışmalardan bahsedeceğim. Malumunuzdur ki CRISPR/Cas9 teknolojisi bir derya deniz. Yapılan herbir çalışma ayrı ayrı irdelenmeyi hak ediyor. Ama yazı çok uzar ve amacından sapabilir. O yüzden sizlere ışık tutabilmek için yaklaşık 3 yıldır okuduğum yayınlardan seçmece olarak bazılarını burada paylaşacağım. Hemen hemen hepsi çok yüksek etki faktörlü dergilerde yayımlandı. Konu hakkında daha derin okumalar için kaynakçadan yararlanabilirsiniz.

Bu teknoloji, birçok nörolojik hastalık da dahil olmak üzere halihazırda tedavi seçeneği olmayan hastalıkların iyileştirilmesinde (7), nöronal işlevlerle davranışların ve nörobiyolojik hastalıkların altında yatan genetik ve epigenetik mekanizmaların anlaşılmasında büyük bir potansiyel barındırmaktadır (8). Duchenne Musküler Distrofi‘li (DMD) farelerde hatalı distrofin geni kesilmiş ve yeniden tamir mekanizması ile tekrardan genin ekspresyonu sağlanmış (9). İn vitro yapılan başka bir çalışmada ise kardiyomyositlerde sorunlu ekzon bölgeleri hedef alınarak DMD ile ilişkili kardiyak anormalliklerin düzeltilebileceği bildirilmiş (10). Yine in vitro olarak; Frajil X sendromundan sorumlu FMR1 genindeki CGG tekrarı (11) ve huntington hastalığından sorumlu huntingtin genindeki CAG tekrarı önlenmiş (12). Uyarılmış Pluripotent Kök Hücrelerden ve fibroblastlardan insan nöron hücrelerinin yeniden programlanması başarılmış (13). Çeşitli nörolojik hastalıkların tedavisi için otolog Schwann hücrelerinin ve mezenkimal kök hücrelerin daha etkin düzenlenebileceği bildirilmiş (14). SCN1A fonksiyon kaybı mutasyonunun neden olduğu epilepsilerin patofizyolojisi aydınlatılmış (15). Yine CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanarak kanal mutasyonlarının tamir edilip, kanalopatilerin tamamen tedavi edilebileceği öngörülüyor (16). Sinaptotagmin I’in (Syt1) hedeflendiği bir çalışmada ise fare hipokampusunun dentat girusundaki inhibitör uyarı uyarılarak dentat girusun öğrenme ve afektif süreçlerde belirgin düzenleyici rollere sahip olduğu bulunmuş. Bu çalışma, CRISPR/Cas9 teknolojisinin memeli beynindeki gen fonksiyonunun daha hızlı araştırılması için yararlı bir araç olabileceğini göstermekte (17). Yine CRISPR/Cas9 sayesinde alzaymer, parkinson, amiyotrofik lateral skleroz, spinal musküler atrofi ve ataksi-telanjiektazi gibi nörodejeneratif bozukluklarda daha kısa sürede ve daha etkin hayvan modelleri oluşturulabileceği bildirilmiş (18).

Ding ve ark. farelerde yüksek LDL seviyesi ile ilişkili olan PCSK9 genini sayesinde mutasyona uğratmayı başardılar (19), daha sonraki çalışmalarında ise aynı başarıyı in vivo insan hepatositlerinde tekrarladılar (20), kalp yetmezliğinde kalbin işlevini artırabilmek amacıyla SERCA2a geninin hedef alındığı çalışmalar faz 2’ye kadar ilerlemiştir (21), akut allograft reddine yönelik de CD4+ yardımcı T lenfositlerin tepkisini hafifletmek için yine CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak MHC2 moleküllerinin hedef alınması planlanmaktadır (22), Xie ve ark. ise PRKAG2 genindeki mutasyon ile ilişkili PRKAG2 kardiyak sendroma yönelik fare deneylerinde başarılı sonuçlar elde etmişlerdir (23). Ayrıca CRISPR/Cas9 teknolojisi, kalp-damar hastalıklarında insan genetik varyasyonunun işleyişini incelemek için deney hayvanlarının hızlı ve etkili biçimde üretimini de kolaylaştıracaktır (24). 

Bu teknoloji özellikle kanserle ilgili çalışmalarda yoğun bir şekilde kullanılmaktadır. Örneğin: Fare melanoma hücrelerindeki PTPN2 geninin immünoterapilere dirençte rol aldığı keşfedildi (25). İnsan metastatik melanoma ve akciğer kanseri hücrelerinde ise immünoterapilere dirence APLNR genindeki mutasyonların neden olabileceği saptandı (26).Prostat ve karaciğer kanseri farelerinde ise MAN2A1-FER füzyon geninin kesilmesinin tümör yükünde azalma sağladığı bildirildi (27). Fare embriyonik fibroblast hücrelerindeki TUDOR-SN geninin kesilmesi ile hücre büyümesinin yavaşladığı tespit edildi (28). Organoidler üzerinde yapılan bir çalışmada ise MLH1 VE NTHL1 genlerindeki mutasyonların kolon kanseri ve meme kanseri gelişimine neden olduğu gözlemlendi (29). Dahası CRISPR/Cas9 tekniği ile üretilen CAR-T hücrelerinin (CAR-T hücre tedavisi bazı hematolojik malinitelerin tedavisinde FDA onayı almıştır. Belki de kanser immünoterapisinde en heyecan verici gelişmelerden biridir. İlerleyen zamanlarda bu konu hakkında da yazacağım.) geleneksel yöntemlerle üretilen CAR-T hücrelerine kıyasla kanser hücrelerine karşı daha etkin olduğu bildirildi (30). Ayrıca CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak deneysel çalışmalar için çeşitli kanser modelleri de oluşturulmaktadır (31). Bu gelişmelerin yanı sıra 2016 itibariyle CRISPR/Cas9 teknolojisinin kullanıldığı ilk klinik deney akciğer kanseri hastalarında başladı (32) ve 2018 itibariyle 20’den fazla klinik deney devam etmekteydi (33). Şubat 2019’da da beta talasemi ve orak hücreli anemi hastalıklarında yine CRISPR/Cas9 teknolojisinin kullanılacağı faz1/2 çalışmaları başlandı (34). Şayet bu yazdıklarımdan sonra CRISPR/Cas9 teknolojisi ilginizi çektiyse (ya da halihazırda ilginizi çekmekteyse) NEJM dergisinde yayımlanmış çok yeni iki yazıyı da okumanızı tavsiye ederim. (35,36)

Tabi olaya hep beyaz tarafından bakmayalım. CRISPR/Cas9 teknolojisi ile ilgili derin endişeler de mevcut. Bunlardan en önemli ikisi şu: etik ve güvenirlilik. Genoma bilhassa embriyonel dönemde müdahale etmek etik olarak çok tartışmalı bir konu.  Bir de bu teknoloji ile hedef bölgelere %100 özgüllükte müdahale edebilmemiz şu an için mümkün değil. Küçük bir hata payının olması bile geri dönüşsüz hasarlara sebep olabilir. O yüzden heyecanlı olmak kadar temkinli olmak da önemli. Ama gelecek adına bilimden ümit duyduğumu belirtmek isterim.

Sonuç olarak mevcut veriler yakın bir gelecekte CRISPR/Cas9 teknolojisinin klinikte yaygın olarak kullanılabileceğini ve CRISPR/Cas9teknolojisine dayalı yaklaşımların geniş bir tedavi potansiyeli barındırdığını göstermektedir. Geleceğin hekimleri olarak bizler de bu tedavi yöntemine kendimizi hazırlamalıyız. Hatta ve hatta bizzat bu alandaki çalışmalara dahil olmalıyız.  Bu yazı ile CRISPR/Cas9 teknolojisi ve bu teknolojinin tıptaki kullanım olanakları hakkında umarım bir farkındalık oluşturabilmişimdir. Sağlıcakla ve bilimle kalın.

Kaynakça:

1. Jiang F, Doudna JA. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annu Rev Biophys. (2017)
2. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337, 816-820. (2012)
3. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, and Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols 8, 2281-2308. (2013)
4. Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI and Liu DR. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471. (2017)
5. Liao HK, Hatanaka F, Araoka T et. al. In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell 171, 1495-1507. (2017)
6. Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Franklin B, Kellner MJ, Joung J, Zhang F. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019-1027. (2017)
7. McMahon MA, Cleveland DW. Gene therapy: Gene-editing therapy for neurological disease. Nat Rev Neurol;13(1):7-9. (2016)
8. Savell KE, Day JJ. Applications of CRISPR/CAS9 in the mammalian central nervous system. Yale J Biol Med; 90(4):567-581. (2017)
9. Long C, Amoasii L, Mireault AA, et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science; 351:400-3. (2016)
10. Long C, Li H, Tiburcy M, et al. Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing. Sci Adv; 4(1):1-11. (2018)
11. Xie N, Gong H, Suhl JA, Chopra P, Wang T, Warren ST. Reactivation of FMR1 by CRISPR/Cas9-mediated deletion of the expanded CGG-repeat of the fragile X chromosome. PLoS One; 11(10):1-12. (2016)
12. Shin JW, Kim K-H, Chao MJ, et al. Permanent inactivation of Huntington’s disease mutation by personalized allele-specific CRISPR/Cas9. Hum Mol Gen; 25(20):4566–4576. (2016)
13. Rubio A, Luoni M, Giannelli SG, et al. Rapid and efficient CRISPR/Cas9 gene inactivation in human neurons during human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Sci Rep; 6(1):1-16. (2016)
14. Madigan NN, Staff NP, Windebank AJ, Benarroch EE. Genome editing technologies and their potential to treat neurologic disease. Neurology; 89(16):1739-1748. (2017)
15. Liu J, Gao C, Chen W, et al. CRISPR/Cas9 facilitates investigation of neural circuit disease using human iPSCs: Mechanism of epilepsy caused by an SCN1A loss-of-function mutation. Transl Psychiatry; 6(11):1-9 (2016)
16. Wykes RC, Lignani G. Gene therapy and editing: Novel potential treatments for neuronal channelopathies. Neuropharmacology; 132:108-117. (2018)
17. Zheng Y, Shen W, Zhang J, et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nat Neuroscience (2018)
18. Holm IE, Alstrup AKO, Luo Y. Genetically modified pig models for neurodegenerative disorders. J Pathol; 238(2):267-287. (2016)
19. Ding Q, Strong A, Patel KM,2 Sze-Ling Ng, Gosis BS, Regan SN, Rader DJ, Musunuru K. Permanent Alteration of PCSK9 With In Vivo CRISPR-Cas9 Genome Editing. Cir Res. (2014)
20. Wang X, Raghavan A, Chen T, Qiao L, Zhang Y, Ding Q, Musunuru K. CRISPR-Cas9 Targeting of PCSK9 in Human Hepatocytes In Vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2016)
21. Rincon MY, VandenDriessche, T. & Chuah MK, Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovasc Res. 108, 4-20 (2015).
22. Abrahimi, P. et al. Blocking MHC class II on human endothelium mitigates acute rejection. JCI insight 1 (2016).
23. Xie C, Zhang YP, Song L, Luo J, Qi W, Hu J, Lu D, Yang Z, Zhang J, Xiao J, Zhou B, Du JL, Jing N, Liu Y, Wang Y, Li BL, Song BL, Yan Y. Genome editing with CRISPR/Cas9 in postnatal mice corrects PRKAG2 cardiac syndrome. Cell Res. (2016)
24. Zhu QM, Ko KA, Ture S, Mastrangelo MA, Chen MH, Johnson AD, O’Donnell CJ, Morrell CN, Miano JM, Lowenstein CJ. Novel Thrombotic Function of a Human SNP in STXBP5 Revealed by CRISPR/Cas9 Gene Editing in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2016)
25. Manguso RT, Pope HW, Zimmer MD et. al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature 547, 413-418. (2017)
26. Patel SJ, Sanjana NE, Kishton RJ et. al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature 548, 537-542. (2017)
27. Chen ZH, Yu YP, Zuo ZH, Nelson JB, Michalopoulos GK, Monga S, Liu S, Tseng G, and Luo JH. Targeting genomic rearrangements in tumor cells using Cas9-mediated insertion of a suicide gene. Nature Biotechnology 35, 543-550. (2017)
28. Elbarbary RA, Miyoshi K, Myers JR, Du P, Ashton JM, Tian B, Maquat LE. Tudor-SN–mediated endonucleolytic decay of human cell microRNAs promotes G1/S phase transition. Science 356, 859-862. (2017)
29. Drost J, Van Boxtel R, Blokzij F et al. Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer. Science 358, 234-238. (2017)
30. Eyquem J, Mansilla-Soto J, Giavridis T, Van der Stegen SJC, Hamieh M, Cunanan KM, Odak A, Gönen M and Sadelain M. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature 543, 113-117. (2017)
31. Liu T, Shen JK, Li Z, Choy E, Hornicek FJ, and Duan Z. Development and Potential Applications of CRISPR-Cas9 Genome Editing Technology in Sarcoma. Cancer Letters 373, 109-118. (2016)
32. Cyranoski D. CRISPR gene-editing tested in a person for the first time. Nature 539, 479. (2016)
33. Le Page M. Boom in human gene editing as 20 CRISPR trials gear up. https://www.newscientist.com (E.T 11.2.2018)
34. ? CRISPR Therapeutics and Vertex Announce Progress in Clinical Development Programs for the Investigational CRISPR/Cas9 Gene-Editing Therapy CTX001. https://globenewswire.com (E.T 25.02.2019)
35. Rosenbaum L. The Future of Gene Editing-Toward Scientific and Social Consensus. N Engl J Med 380:971-975 (2019)
36. Porteus MH. A New Class of Medicines through DNA Editing. N Engl J Med 380:947-959 (2019)