CASCADE-CAS3 SİSTEMİ

2020 Nobel Kimya Ödülü: CRISPR

Yazıma başlamadan ve konuya daha detaylı bakmadan önce, incelediğim makalenin belki de ‘ilham kaynağı’ sayılabilecek yönteminden genel olarak bahsetmek istiyorum: CRISPR. Çoğumuz belki de bu gelişmenin adını geçtiğimiz haftalarda Kimya alanında verilen Nobel ödülü ile duydu, birazımız da zaten biliyor ve takip ediyordu. Bu seneki Nobel Kimya Ödülü, CRISPR tekniğinin üzerinde çalışan ve onu geliştiren bilim insanlarına verildi. Bu durum ve halihazırda yürütülmekte olan birçok araştırma, bizlere gen editleme tekniklerinin potansiyelini ve önemini gösterdi. Aslında bakterilerden esinlenerek laboratuvarlarda yaygın bir şekilde kullanılan bir teknik haline gelen CRISPR; aynı zamanda iyileştirilmeye, hızlandırılmaya ve belki de daha da spesifik hale getirilmeye açık olabilecek olan bir yöntemdir. Çalışmalarda yoğun olarak kullanılan CRISPR-Cas9 sistemi, spesifik bir bakteri enzimi kullanılarak çalışmaktadır. Ancak Cas9, benzer işlevleri yerine getirmek için kullanılabilecek tek enzim de değildir. University of California, San Francisco’daki araştırmacılar da Cas9’dan daha iyi alternatifler kullanılabilir mi sorusuna cevap arayıp araştırmalarını yürütmüş ve bunu test etmek için de Cas3 enzimini kullanmaya karar vermişlerdir. 19 Ekim 2020 tarihinde Nature Methods’da yayımlanan makalenin araştırmacılarından Joseph Bondy-Denomy, kullandıkları enzimin hedefini bulmasının üzerine DNA üzerinde ilerleyip bu kısmı Pac-Man karakterine benzer bir biçimde kestiğini belirtmiştir (CRISPR Meets Pac-Man: New DNA Cut-and-Paste Tool Enables Bigger Gene Edits — ScienceDaily, 2020)

Farklı CRISPR Sistemleri

CRISPR sistemleri, halihazırda ökaryot ve prokaryot canlılarda gen düzenleme süreçlerini mümkün kılmaktadır ancak bazı sistemlerde kullanılan Cas-9 ve Cas-12 enzimlerinin büyük delesyonlar yapma kabiliyetleri sınırlıdır (Csörgő et al., 2020). Sahip oldukları alt yapı sayısına göre CRISPR-Cas sistemleri iki sınıfa ayrılmaktadır: Sınıf 1 (birden fazla parça) ve Sınıf 2 (bir parça) ve sınıf 1 CRISPR sistemleri doğada daha da sık görülmektedir (Koonin & Makarova, 2019). Genellikle literatürdeki CRISPR üzerine yapılmış olan çalışmalar, tek parçalı sınıf 2 CRISPR sistemlerine odaklanmıştır (Barrangou & Doudna, 2016) ancak birkaç parçalı olan sınıf 1 sistemleri de çalışmalarda çok önemli gelişmeler yaşanmasını sağlayabilir. Cas-3, aynı zamanda sahip olduğu parçalar sayesinde büyük gen parçalarının kesilmesinde de sınıf 2 enzimlere kıyasla daha verimli bir şekilde kullanılabilir (Csörgő et al., 2020). Bu düşünceden yola çıkarak da Csörgő ve ekibi, P. aeruginosa’dan alınıp hedefe göre yeniden şekillendirilen bir CRISPR sistemini test etmişlerdir. Bahsi geçen Cascade-Cas3 sistemiyle yapılan genom bazındaki değişikliklerin, günümüzde başka teknikler kullanılarak yapılması mümkün gözükmemektedir (Csörgő et al., 2020). Bu sistemde Cas proteinleri ve crRNA’nın bir araya gelerek oluşturduğu Cascade kompleksi (Brouns et al., 2008), hem belli bir DNA dizisinin hedeflenmesini mümkün kılmakta hem de o noktaya ulaşıldığında (aşağıdaki resimde gösterildiği gibi) Cas3 enzimini çağırmaktadır (Rath et al., 2015). 

Cas3 Niye Özel?

CRISPR-Cas3 sistemleri, insan genomunda uzun hedef kısımları kesebilme kabiliyetleriyle Cas9 gibi sistemlerden ayrılmaktadır (CRISPR-Cas3 Innovation Holds Promise for Disease Cures, Advancing Science — ScienceDaily, 2019). Bu özelliğinin, onun gelecekte kullanımını artıracağı düşünülmektedir. Örneğin, halk sağlığında önemli sayılan ektopik virüslerin hedeflenmesinde kullanılabilir. CRISPR-Cas3 üzerine çalışan bir diğer bilim insanı, Ailong Ke, üzerine çalıştıkları sistemlerin böyle virüsleri çok spesifik bir şekilde hedefleyip silebileceğini, dolayısıyla da ilerde viral hastalıkların tedavisinde kullanılabileceğini dile getirmiştir (CRISPR-Cas3 Innovation Holds Promise for Disease Cures, Advancing Science — ScienceDaily, 2019). 

Bunun haricinde, Cas3 sistemleri DNA’nın kodlamayan kısımlarını da araştırmak için elverişli olabilir. Genetik alanında çok ilerlemiş olsak da hala bu kısımların işlevlerine dair çok derin bir bilgi birikimimiz bulunmamaktadır. CRISPR-Cas3 de kodlamayan kısımlar için genomu tarayıp bunlarda değişiklikler yaparak veya onları silerek işlevlerinin model organizmalarda araştırılmasını mümkün kılabilir. 

Yine de çoğu deneyde olduğu gibi, Cascade-Cas3 sistemini inceleyen araştırmacılar da yöntemlerinin planlandığı kadar verimli çalışmasına engel olabilecek etkenleri de gözetim altına almayı sürdürmüşlerdir. Bunlardan biri, CRISPR-Cas3 sisteminin yaptığı kesimin sınırlarının bazen kesin olarak belirlenememesidir (CRISPR-Cas3 Innovation Holds Promise for Disease Cures, Advancing Science — ScienceDaily, 2019). Aşılması gereken engellerden bir diğeri de bazı profajlarda üretilebilen anti-CRISPR proteinleridir. Araştırmacılar, bakteriyofajda AcrIC1 adlı bir anti-CRISPR proteini bulunuyorsa bakterinin CRISPR-Cas3 sisteminin aktivitesini engelleyebildiğini, ancak Cas9 inhibitörünün aynı aktiviteyi gerçekleştirmediğini kaydetmişlerdir. Anti-CRISPR proteinlerine karşı bir önlem olarak da ‘anti-anti-CRISPR’ stratejisi denenmiş, CRISPR sistemlerini engelleyen proteinlerin sentezini baskılayan başka bir protein kullanılmaya çalışılmıştır. Dolayısıyla da anti-CRISPR proteinlerini baskılayan etmenlerin CRISPR-Cas sistemlerinin etkinliğini daha verimli hale getirecek olduğu düşünülmüştür. Başka bir bakış açısından bakarak araştırmayı yürüten araştırmacılardan Joseph Bondy-Denomy; CRISPR’a karşı fajlar tarafından geliştirilmiş bu tip mekanizmaların, insanlarda kullanılan Cas tedavilerinde tespit edilen yan etkileri, zarara yol açmadan önce durdurmak için de kullanılabileceğini dile getirmiştir (CRISPR Meets Pac-Man: New DNA Cut-and-Paste Tool Enables Bigger Gene Edits — ScienceDaily, 2020).  

Çalışmalar bizi nereye götürüyor?

Bu çalışma, CRISPR-Cas3 sistemlerinin ökaryot hücrelerinde, özellikle tekrar eden ve uzun kısımların hedef alınmasındaki potansiyelini öne koymuş, aynı zamanda bu sistemin geri kalabileceği alanlardan da bahsetmiştir. Anlattıklarım ve genel olarak CRISPR hakkında daha detaylı bilgi almak isterseniz kaynakçamda belirttiğim makalelere ulaşabilirsiniz. Hala gelişmekte olan ve içinde çok yeni teknikler barındıran bu konuda daha fazla araştırmaya ihtiyacımız var. DNA’da daha büyük kısımların kesilebilmesi, daha çok genin işlevini anlayabilmemizi de beraberinde getirecektir. Aynı zamanda, bu tarz işlevsel bir sistem bakterilerde metabolizma değişikliklerine neden olabilen gen parçalarının da ayıklanabilmesini sağlayarak (CRISPR Meets Pac-Man: New DNA Cut-and-Paste Tool Enables Bigger Gene Edits — ScienceDaily, n.d.) biyoteknoloji çalışmalarını da ileri taşıyabilir. 

Kaynakça 

Barrangou, R., & Doudna, J. A. (2016). Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. https://doi.org/10.1038/nbt.3659

Brouns, S. J. J., Jore, M. M., Lundgren, M., Westra, E. R., Slijkhuis, R. J. H., Snijders, A. P. L., Dickman, M. J., Makarova, K. S., Koonin, E. V., & Van Der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science,321(5891), 960–964. https://doi.org/10.1126/science.1159689

CRISPR-Cas3 innovation holds promise for disease cures, advancing science — ScienceDaily. (2019). https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190411172519.htm

CRISPR meets Pac-Man: New DNA cut-and-paste tool enables bigger gene edits — ScienceDaily. (n.d.). Retrieved November 6, 2020, from https://www.sciencedaily.com/releases/2020/10/201020105551.htm

Csörgő, B., León, L. M., Chau-Ly, I. J., Vasquez-Rifo, A., Berry, J. D., Mahendra, C., Crawford, E. D., Lewis, J. D., & Bondy-Denomy, J. (2020). A compact Cascade–Cas3 system for targeted genome engineering. Nature Methods. https://doi.org/10.1038/s41592-020-00980-w

Goodsell, D. S. (2015). Cascade and CRISPR. RCSB Protein Data Bank. https://doi.org/10.2210/rcsb_pdb/mom_2015_1

Koonin, E. V., & Makarova, K. S. (2019). Origins and evolution of CRISPR-Cas systems. In Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences (Vol. 374, Issue 1772). Royal Society Publishing. https://doi.org/10.1098/rstb.2018.0087

Pickar-Oliver, A., & Gersbach, C. A. (2019). The next generation of CRISPR–Cas technologies and applications. In Nature Reviews Molecular Cell Biology. https://doi.org/10.1038/s41580-019-0131-5

Rath, D., Amlinger, L., Hoekzema, M., Devulapally, P. R., & Lundgren, M. (2015). Efficient programmable gene silencing by Cascade. Nucleic Acids Research, 43(1), 237–246. https://doi.org/10.1093/nar/gku1257